マラリア原虫の微小管構造の変化 | 株式会社建具江蘇ULの

Nature Communications volume 14、記事番号: 1216 (2023) この記事を引用

2456 アクセス

11 オルトメトリック

メトリクスの詳細

微小管は、遍在する真核生物の細胞骨格要素であり、通常は中空円筒内に配置された 13 本のプロトフィラメントから構成されます。この配置は標準的な形式と考えられており、まれな例外を除いてほとんどの生物に採用されています。ここでは、その場電子クライオ断層撮影法とサブボリューム平均化を使用して、マラリアの原因物質である熱帯熱マラリア原虫の微小管細胞骨格の変化をそのライフサイクル全体にわたって分析します。予想外なことに、さまざまな寄生虫の形態は、独自の組織化中心によって調整された異なる微小管構造を持っています。最も広く研究されている形態であるメロゾイトでは、標準的な微小管が観察されます。移動する蚊の形態では、13本のプロトフィラメント構造は、分断された内腔ヘリックスによってさらに強化されます。驚くべきことに、生殖母細胞には、13 ～ 18 個のプロトフィラメント、ダブレット、トリプレットの範囲にわたる広範囲に分布した微小管構造が含まれています。このような微小管構造の多様性は、これまで他の生物では観察されておらず、おそらく各生活環形態における異なる役割の証拠であると考えられます。このデータは、関連するヒト病原体の異常な微小管細胞骨格についての独自の見解を提供します。

微小管は真核生物のすべての枝にまたがる重要な細胞骨格構成要素であり、細胞内輸送のための軌道、移動のための構造的支持、および染色体分離のための紡錘体を形成します。 α-/β-チューブリンヘテロ二量体の重合によりプロトフィラメントが形成され、これが横方向に相互作用して集合して中空円筒になります。 13 プロトフィラメント微小管は、この構造が広く研究されている真核生物のスーパーグループ内で最も一般的に観察されているため、標準的であると考えられています。初期の電子顕微鏡学者は、非標準的な微小管の例を複数発見しました 1 が、一部の種から機能的な天然チューブリンを精製することの難しさとモデル生物への過度の依存により、私たちの微小管生物学の理解は主に後生動物の微小管の研究に基づいています。線虫の特殊な細胞の 11 プロトフィラメント微小管 2,3 や内耳柱細胞の 15 プロトフィラメント微小管 4,5 などの非標準的な例は、興味深い外れ値であると考えられています。その結果、原生動物は大きくて多様なグループですが、その微小管に関する仮説の多くは後生動物の研究から推測されたものであることがわかりました。

Plasmodium spp.の真核生物寄生原虫は、その主な構造細胞骨格成分として規則正しい膜下微小管（SPMT）の足場に依存しています。マラリアの原因物質である熱帯熱マラリア原虫は、媒介蚊とヒト宿主の間を行き来する複雑な生活環を持っています（図1）。 2 つの宿主による広範な共進化により、病原体は高度に特殊化され、形態学的に異なる多数の細胞型 (ここでは型と呼ばれます) を利用するようになりました。それぞれの形態は明確なニッチのマスターであり、形態学的に多様ですが、SPMT の存在は統一的な特徴です。 SPMT は細胞膜の下に位置し、細胞膜の下にある内膜複合体 (IMC) として知られる二重膜と相互作用します。これらの構造はまとめてペリクルと呼ばれ、例えばトキソプラズマ・ゴンディを含むアピコンプレックス全体に見られます。薄膜は移行時に分解され、その後、各生活環形態の成熟中に再構築され、そのたびに異なる関連タンパク質のセットが伴います6、7。この新たな再組織化は、寄生虫の実質的な形態学的変化の背後にある原動力であり、SPMT はこのプロセスで重要な役割を果たしています8。

ここで研究された寄生虫形態の単純化されたマラリア原虫のライフサイクル。スポロゾイトは宿主に注入されます。肝臓で分化した後、メロゾイトは血液中に放出されます。大多数は無性生殖サイクル（メロゾイト）に入り、少数は生殖母細胞になることに専念します。配偶子母細胞は蚊によって取り込まれ、蚊の腸内で雄と雌の配偶子が融合した後、接合子はオーキン体に変化します。オーキネテスは蚊の中腸を通過し、オーシストに成長して数千のスポロゾイトを形成し、唾液腺に移動します。 b ワークフローの概略図: (i) 生きた寄生虫が EM グリッド上でガラス化されます。 (ii) 細胞は薄板状に薄化され、その後、(iii) 電子クライオ断層撮影法 (cryo-ET) によって画像化されます。傾斜シリーズが収集され、計算によって 3D ボリュームに再構築されます。 c 列 1 ～ 4: さまざまなワークフローステップにおける寄生虫の代表的な画像。 1: 寄生虫の全体的な形状を強調する細胞の蛍光画像の合成。挿入図: 各ステージの漫画表現。 2: 走査型電子顕微鏡 (SEM) 顕微鏡写真。宿主細胞 (緑色の星印) に囲まれたマラリア原虫寄生虫 (一部は黄色と緑色に擬似的に着色されている) を示しています。 3: ラメラの概要を示す顕微鏡写真。 4: 断層像の例をスライスします。

真核生物のチューブリンは高度に保存されていますが、アピコンプレックス微小管を際立たせる顕著な違いがあります。この寄生虫の SPMT は非常に安定しており、低温処理 9、微小管解重合薬 10 および界面活性剤 11、12 の添加など、ほとんどの古典的な解重合プロトコルに耐性があります。アピコンプレクサチューブリンに特有のもう 1 つの特徴は、付属タンパク質とともにコノイドと呼ばれるらせん構造を形成する L 字型の半細管の形成です。円錐体は侵入に関与する特殊な構造です。トキソプラズマで特徴付けられていますが、いくつかの円錐形成分の相同体はプラスモジウム属 spp.15 で発現されます。

精製チューブリンから in vitro で組み立てられた微小管は 9 ～ 16 本のプロトフィラメントで構成されており、プロトフィラメント数の分布は使用する種や条件に応じて異なります 1,16。これらの変化は細胞内では通常見られないため、外部要因による核形成中に均一な 13 プロトフィラメント微小管集団の規定を確立する必要があります。微小管内のプロトフィラメントの数を制御するには 4 つの一般的な機構があります。 γ チューブリン環複合体 (γTuRC) によるテンプレート化 17,18、ダブルコルチンなどのタンパク質の側方結合による特定のプロトフィラメント間の角度の設定 19,20、異なるチューブリンアイソフォーム21または翻訳後修飾22。後生動物では、微小管の核形成は通常、中心体（微小管組織化中心、MTOC）で起こります。侵入型のアピコンプレクサ寄生虫では、その頂端に位置する構造的に多様なMTOCである頂端極環（APR）がSPMTの高次の空間制御を調整している23が、その具体的な機構は依然として不明である。

Plasmodium spp の微小管の多様性を直接視覚化するために、極低温集束イオンビーム (FIB) ミリング、電子断層撮影 (cryo-ET)、およびサブボリューム平均化 (SVA) を使用して、自然条件下で 4 つの異なる寄生虫のライフサイクル形態を画像化しました (図 1)。）。これらの構造をネイティブな状況で 3D で明らかにすることにより、各寄生虫の形態が明確で特殊な微小管構造を持ち、一部は標準的な微小管とは実質的に異なる、珍しい細胞骨格構造を明らかにします。

さまざまなマラリア原虫の形態における微小管のその場構造を決定するために、2 つの蚊 (スポロゾイトとオキネテス) と 2 つのヒトの形態 (メロゾイトと生殖母細胞、図 1) に対して FIB ミリングとクライオ ET を実行しました。ターゲットを絞ったFIBミリング（図1b）を実行して、寄生虫を含む場所に50 nm〜300 nmの厚さのラメラを生成しました。当初、EM グリッド上でガラス化された寄生虫を識別するために相関光学電子顕微鏡法 (CLEM) が使用されました。後に、SEM でのそれらの独特の形状 (図 1c、列 2) により、相関関係なくターゲティングが可能であることがわかりました。各段階で、さまざまな細胞内領域を良好にカバーするために、約 20 枚のラメラから 50 ～ 100 枚の断層像を取得しました。すべての微小管に対して網羅的に SVA を実行するために手動ピッキングを実行し、完全な超微細構造モデルを生成し、統計分析を可能にしました。潜在的なバイアスを回避するために、データセット内の約 850 個の微小管すべてが SVA を使用して独立して分析されました。これにより、各細胞内および 4 つの生活環形式間の両方で、プロトフィラメントの数や相対的な極性 24 を含む構造の変動を調査することができました。

私たちは、媒介蚊から分離された寄生虫の形態であるスポロゾイトとオキネテスを画像化することから研究を開始しました。これらの運動性の形態は、IMC の下に高密度の SPMT 足場を備えて伸長しています。一見したところ、スポロゾイトとオーキンテの両方の SPMT の内腔には、約 8 nm の周期性を持つ (擬似) らせん密度が含まれており、これは以前の予測と一致しています (図 2、3)。不偏の EM 密度マップを生成するために、422 個のスポロゾイトと 177 個のオーキナイト SPMT を、(擬似) 対称性を適用せずに SVA によって分析しました。得られた構造は両方とも、2回中断された内腔ヘリックスを持つ13プロトフィラメント微小管を示しました（図2b〜d、3c）。中断内腔ヘリックス (ILH) と呼ばれる同様の構造は、ヒトの精子の鞭毛端で最初に観察され 25、最近ではウマやブタの精子 26、トキソプラズマゴンディのタキゾイトで観察されました 14,27。 Zabeo et al25 の命名法を採用しました。 T. gondii ILH は、チオレドキシン様タンパク質 1 および 2 (TrxL1、TrxL2) と皮下微小管タンパク質 1 (SPM1) から構成されます。我々は、プラスモジウム属とトキソプラズマ属の ILH はおそらく相同タンパク質で構成されているのではないかと仮説を立てました。これらは、TrxL1 (PfTrxL1) および SPM1 (PfSPM1) の相同体を持っていますが、TrxL2 を欠いており、トキソプラズマ ILH では両方に存在し、2 つの中断のうちの 1 つを完全に満たします。一貫して、我々は、マラリア原虫の二回中断された内腔ヘリックスのみを観察した。第二に、Plasmodium の SPM1 と TrxL1 で構成されている ILH と互換性があり、Plasmodium berghei (Pb) では内因性タグ付きスポロゾイト株の PbSPM1-GFP と PbTrxL1-GFP の高い発現が見られました (図 S2)。最後に、プラスモジウムおよびトキソプラズマの TrxL1 および SPM1 は高度に保存されており 12 (図 S1a、b)、T. gondii SPMT アセンブリのモデル (pdb 7MIZ) は EM マップによく適合します (図 2c、d)。 ILH の非対称な性質により、T. gondii の ILH 構造を Plasmodium SPMT の EM 密度に適合させる方法は 1 つしかありません。したがって、熱帯熱マラリア原虫ILHは10コピーのPfTrxL1で構成されており、おそらく2つの半三日月に分離された同数のPfSPM1を含むと考えられます（図2c）。これにより、構造内の継ぎ目の位置とα-βチューブリンの位置の両方を特定する信頼性の高い方法も提供されました（図2c、d）。

a 細胞内のペリクルの全体的な構造を示す断層像のスライス。 1 つの SPMT がスライス面に出入りしているのが見えます。挿入図: SVA によって決定された位置で断層像に戻された EM マップのスライス (B、C、D に表示)。 b EM マップを直交スライスします。 c EM 密度に適合した擬似原子モデル (7MIZ) を使用した EM マップの等値面表現。 p1～p13 = プロトフィラメント番号、点線 = 縫い目の位置。 d 上: TrxL1に対するα/βチューブリン二量体の位置を示すEMマップの断面図。下: ILH の 1 周期を紫色で強調表示した放射状投影。 e 完全な微小管セット (青色 13 本 + 緑色 1 本) を備えた熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトの頂極。 APR は等値面、SPMT はピンモデルとして表され、ピンの頭が中心をマークし、線が継ぎ目の方向を向いています。 f セグメント化されたスポロゾイトの頂極。 2 つの SPMT のチューブリン密度 (13 プロトフィラメント) を隠して、ILH を明らかにしました。図S3aに示す注釈のない断層像と補足ムービーS1の全ボリューム。

SPMT が根尖基底軸に沿って配向された、オーキンテの根尖端を通る断層像。右側のオーキンテの漫画は、a、b、d のラメラのおおよその中心位置を示しています。 b SPMT を横方向に切断して、オキネット頂点近位領域をスライスします。注釈の色は a と同じです。 SPMT は、内側の頂端カラーが (左から右に) 先細になるにつれて IMC に近づきます。 SPMT の回転方向 (中心から継ぎ目まで) は矢印で示されています。 c ookinete SPMTのSVAによって決定されたEMマップによる直交セクション。 d SPMTとIMCの間の2つの頂端カラー層を強調した、横方向に切断されたSPMTを備えたオーキンテの頂端近位領域のセグメント化。円錐は緑色で表示されます。 e オーキネットの頂極の分割。 1 つの SPMT のチューブリン密度は、ILH を明らかにするために隠されました。挿入図は、円錐周期構造の平均体積のスライスを示しています。図S3bに示されている注釈のない断層像と補足ムービーS2のフルボリューム。

これまでに解明されているほとんどの微小管構造は断面が円形に近いが、ILHを含むマラリア原虫微小管と、程度は低いがILHを含むT. gondii微小管（図S1c、d）は、ほぼプロトフィラメント2と9の間の仮想軸に沿って平らになっている。これは、ILHがプロトフィラメント間の角度を約26°で安定させ、標準的な13プロトフィラメント微小管の理論上の27.7°から約2°逸脱していることを意味します（図S1c、d）。円形断面からの逸脱は 5 つのサブユニットにわたって蓄積され、プロトフィラメント 6 と 7、および 12 と 13 の間の 37° の相対角度によって補償されます。プラスモディウムの TrxL1 の予測構造と T. gondii の構造を比較すると、最大の構造が示されました。違いはN末端ヘリックスにあり（図S1e）、これはサブユニット-サブユニット界面の大部分に関与しており、楕円率の増加に役割を果たしている可能性があります。

オーキネートの頂端では、独特のチューブリン構造で構成される古典的な円錐形と一致する構造が観察されました（N = 1、図3e）。平均体積断面積は、T. gondii14 に記載されている L 字型のチューブリンベースのコノイドと一致しています。オーキネートの円錐形は高さ 70 nm、直径 300 nm で、収縮した状態に似ていました。最近まで、マラリア原虫（Aconoidasida 綱に属し、錐体がないことを意味する）は錐体を持たないと考えられていました。私たちのデータは、オーキネットの頂点に円錐状の構造が存在することを示唆する以前の遺伝子、蛍光顕微鏡、および古典的な EM データを検証します 15,28。

私たちの蚊の形態データと T. gondii の最近の構造に基づいて、ILH がアピコンプレクサ微小管の遍在する特徴であることはもっともらしいと思われました。これがすべての生活環の形態に共通する特徴であることを検証するために、次に、ヒト宿主からの熱帯熱マラリア原虫の形態を分析しました。さらに、ILH の存在が SPMT に特異的であるか、または一般的な微小管成分に特異的であるかを評価するために、シゾント発生の 2 つの時点で画像化しました。 SPMT については、完全にセグメント化されたシゾント (メロゾイト) を画像化しましたが、紡錘体微小管については、シゾントの分割を目指しました。無性血液段階であるメロゾイトは、成熟したシゾントから放出され、わずか 2 ～ 3 個の SPMT を持つ小さな細胞です (図 4)。メロゾイトは短命です。非生存細胞の画像化を避けるために、我々は、よく特徴付けられたプロテアーゼ阻害剤（E64）29を使用して、脱出する前にシゾントを停止させ、赤血球膜袋内にメロゾイトを生じさせた。

a 心尖極の断層像をスライスします。挿入図: 13 個のプロトフィラメントを示す微小管サブボリューム平均のスライス。 b 部分的な紡錘体を持つ分割シゾントにおける核の分割。核のこのセクションで観察される 4 つの核孔複合体はすべて紡錘体の近くにあります。挿入図: SPMT EM マップの等値面をスライスします。 c 完全にセグメント化されたシゾント内の単一メロゾイトのセグメント化。注: 簡略化のため、IMC は連続した二重膜としてセグメント化されていますが、複数の不連続性が観察されています。図S3cに示されている注釈のない断層像と補足ムービーS3のフルボリューム。

予想外かつ蚊の形態とは対照的に、メロゾイト SPMT には ILH が存在しませんでした (図 4a、c)。 SVAによる分析により、メロゾイトSPMTは標準的である、つまり13個のプロトフィラメントでできていることが示されました。同様に、分裂中のシゾントからの紡錘体微小管は標準的であり、ILHを欠いていました（図4b）。しかし、キャップのないSPMTとは対照的に、紡錘体微小管は、そのマイナス端にγTuRCに似たキャップ密度を含んでいた（図S4c）30。これは、マラリア原虫の微小管細胞骨格構造が生活環の段階に応じて変化すること、および異なる微小管集団が異なる機構によって核形成される可能性があることを示した。

微小管の構造が蚊の形態と無性のメロゾイトの血液の形態で異なることを明らかにした後、次に有性生殖母細胞の SPMT の研究に着手しました。熱帯熱マラリア原虫の配偶子母細胞は、5 つの形態学的段階を経て、円形から細長い形になり、最終的にはファルシフォームの形に成長します。 SPMT はステージ II で重合を開始し、ステージ IV までに細胞質を完全に取り囲みます。私たちは、成熟プロセスのさまざまな段階で生殖母細胞を濃縮し、その微小管を調査しました。

ペリクルの被覆率はその後の発生段階とともに増加し、それに伴って各細胞内の SPMT の数も増加しました。すべての生殖母細胞の段階において、SPMT 断面の直径は 27 から 37 nm の範囲で著しく大きく変動し、一重項、二重項、三重項 (多くの場合、異常な形状を有する)、さらには四重項の混合物で構成されていました (図 5、S5)。）。これまでに研究されたすべての生物において、細胞質微小管は単一の管（一重項微小管）であり、以前の研究ではより小さな直径の微小管が報告されていたため、これは予想外でした 31。ダブレット (標準的には 13 + 10 のプロトフィラメントからなる) とトリプレットは繊毛と鞭毛に見られ 26,32、トリプレットは中心小体の特徴です。メロゾイト SPMT と一致して、これらの巨大な微小管には ILH の証拠は見つかりませんでした。 SVAは、ダブレットSPMTの約170の一重項および約30のA細管のそれぞれに対して独立して実行され、驚くべきことに、それらが13、14、15、16、17または18のプロトフィラメントで構成されていることを示しました（図5c、表S1）。いくつかの標準的な微小管が存在しましたが、これらは集団の9％のみを占め、17プロトフィラメント微小管が最も頻繁でした（40％）（図5c）。ダブレットも巨大で、そのA細管は同様の分布を持っており、17個のプロトフィラメントが最も一般的でした（図S5b、c）。驚くべきことに、他の生物における 13 プロトフィラメントの A 細管の遍在性を考慮すると、13 本のプロトフィラメントを持つ A 細管は存在しませんでした。プロトフィラメント数の多様性により、生殖母細胞 SPMT 集団は他のすべての形態とは明らかに異なります。これが生殖母細胞に特異的な SPMT 核形成によるものなのか、それとも別のメカニズムによるものなのかは、他の細胞コンパートメントの微小管と比較することで調べることができます。

一列と二重線のSPMT断面を示し、サイズの範囲を強調した顕微鏡写真。プロトフィラメント番号が示されている（A細管のダブレットの場合）。 2 つの異なる傾斜角での顕微鏡写真をつなぎ合わせて、SPMT の横断面像を示しました。 b 核孔複合体における紡錘体極体を備えたステージ III 生殖母細胞の核の分割。 c、dcに示すように、微小管の色はプロトフィラメント数に対応します。SPMT（青）N = 155および核紡錘体（薄紫色）N = 31のさまざまなプロトフィラメント数の分布の棒グラフ。分布は大きく異なります（p = 5×10− 8、カイ二乗)。 d 13 ～ 18 のプロトフィラメント数で平均したサブボリュームからの微小管の等表面。 e 微小管直径の違いの概略図。 f 横方向に切断された SPMT を使用したステージ III 生殖母細胞のセグメント化。 c、dに示すように、微小管の色はプロトフィラメント番号に対応します。「+/-」は各微小管の極性を示します。図S3dに示す注釈のない断層像と補足ムービーS4のフルボリューム。

SPMT の他に、生殖母細胞にはさらに 2 つの微小管集団があります: 核紡錘体 (または半紡錘体 33) と細胞質です。細胞質微小管は寿命が短く、発生中の薄膜から細胞の反対側にある初期段階の配偶母細胞にのみ現れます 34。したがって、細胞質微小管は比較的まれです。プロトフィラメント数の混合（13から16、図S5e）が観察され、プロトフィラメントサイズによるクラスター化の兆候はありましたが、数が低いため確認できませんでした。核微小管は生殖母細胞ステージIII/IVの寄生虫で頻繁に見られ、完全な紡錘体極体が1つの断層像に存在しました（図5b）。紡錘体微小管は13から17のプロトフィラメントの範囲にあり、15が最も一般的です（図5b、c）。プロトフィラメントの数に関係なく、すべてのマイナス末端がγTuRCである可能性のある構造で明らかにキャップされていたため、これは予想外でした（ただし、標準的な形式に比べて平坦です）。特に、γTuRCはこれまでのところ、標準微小管でのみ記載されています（図S4d）。総合すると、このデータは、プロトフィラメント数の広範な分布が、核形成機構ではなく、アイソフォーム発現の差異または翻訳後修飾の結果である可能性があることを示唆しています。

4つの個別の形態間の微小管集団間の実質的な構造の違いを観察したため、我々はSPMTの核形成が起こる頂端集合体に分析を集中させました。侵襲性寄生虫の形態（メロゾイト、スポロゾイト、オーキネート）では、頂端のタンパク質性リング（APR）が独自のMTOCとして機能し、IMCを終結させるだけでなくSPMTを調整します。これと一致して、蚊の形態とメロゾイトの両方のすべての SPMT は同じ極性を持ち、マイナス端は頂端極にあり、プラス端は基底細胞極に向かって伸びています。すべての浸潤性形態において、それらのマイナス末端は平滑であり、γTuRCキャップを欠いていたが、オーキネートマイナス末端の内腔には追加の微小管関連タンパク質（MAP）が存在する可能性がある（図S4a）。しかし、3つの形態すべてが同じ極性の13プロトフィラメントSPMTを含むにもかかわらず、それらの頂端極の構造には大きな違いがありました（図2〜4）。

メロゾイトの頂点は最も単純で、APRから放射状に伸びている微小管が2〜3本だけでした（図4c）。すべての SPMT は、APR の周囲に均等に分散されるのではなく、リングの同じ側で発生しました。スポロゾイトにはより多くの SPMT が含まれていました。 2つの断層像では、13個の密に配置された完全なセットと単一の対向するSPMTを備えた完全なスポロゾイトAPRを見ることができました（図2e、f、S6）。 SPMTのマイナス端は明らかに直接接触しており（図S6a）、APRの頂端と面一でした。ただし、各SPMTは、寄生虫の心尖基底軸から約45°35だけ傾いたリング回転対称軸に対して異なる迎え角を持っていました（図S6c、d）。したがって、SPMT-APR コンタクトには高度な柔軟性が必要です。対照的に、SPMTの半径方向の配向は制限されており、プロトフィラメント6から9が優先的にAPRと接触していました（図S6c）。

最も精巧な頂点はオーキネテスで観察され、単一のリングではなく、非晶質タンパク質の同心円状の 2 層を備えていました (図 3)。形態に大きな違いがあるため、我々はアピカルカラー（AC）という用語を好んで使います15が、機能の類似性からAPRも同様に適切です。両方のリングは基底側で触手に分かれており（図3b、d、e）、内側のACは個々のSPMTに直接接触し、最大〜1μmまで続いています。狭い頂端にこの形で存在する多数のSPMT（〜50〜60）を収容するために、微小管のマイナス端はAC頂端縁から千鳥の位置で始まりました（図3e）。

生殖母細胞は、上記の 3 つの侵入型の明確な極性細胞とは異なり、明確な細胞極性を持っていません (図 2-4)。生殖母細胞の極でMTOCとして機能する可能性のあるAPR様構造またはその他の構造の証拠は観察されず、SPMTは細胞長に沿って明らかに調整されていない位置で発生しました。すべてのSPMTが頂端にマイナス端を備えた同じ極性を有する浸潤型とは異なり、生殖母細胞のSPMTは明らかなランダムな極性を持っていました（図5f、表S1）。さらに、プロトフィラメントまたは二次尿細管の数に関して、IMCに沿ったSPMTの分布には識別可能なパターンはありませんでした（図5f、表S1）。初期の 3 つの形態の SPMT には γTuRC キャップが欠如していることを考慮して、我々は当初、SPMT 核形成因子が APR または AC と物理的に関連している可能性があると仮説を立てていました。しかし、生殖母細胞のSPMTマイナス末端を集中的に分析したところ、それらもキャップされていないことが示されました（図S4）。総合すると、これは、APR と独自に関連するものではない、γTuRC に依存しない核形成機構を示唆しています。

マラリア原虫寄生虫は、その生活環の各段階で微小管構造、MTOC、および高次微小管組織を変化させますが、統一的な特徴の 1 つは SPMT と IMC の相互作用です。 SPMT-IMC相互作用がすべての寄生虫形態で同じように媒介されるかどうかを解明するために、各SPMTの表面からIMC内膜までの最短距離（dIMC）を測定しました（図6）。すべての寄生虫の形態で同様の dIMC が存在することは、同じタンパク質が SPMT の IMC への結合に関与していることを示唆しています。頂端アセンブリを除くと、4つの寄生虫形態間でdIMCに有意な差はありませんでした（共通中央値は18 nm、標準偏差は10 nm、図6d）。この距離は、ACを収容するためにオーキネット頂点で〜50および〜100 nmに増加しましたが、SPMT表面から最も近い表面である内部ACまでの距離はdIMCに匹敵しました（〜13 nm、図6a）。したがって、各ステージは固有の SPMT 構造を持っていますが、SPMT と IMC の間の距離はステージ間で一貫したままであることがわかります。したがって、我々は、分析されたすべての寄生虫形態において、同じタンパク質が SPMT を IMC に結び付けていると仮説を立てます。

パネル a ～ c 左: IMC に対する個々の SPMT 距離 (dIMC) と動径方向 (φIMC) の散布図。各点は、単一の SPMT に沿った中央値を表します。オーキネットおよびスポロゾイトのSPMTは定義された極性を持っていますが、配偶子母細胞の方向はランダムです（これらのデータの2Dヒストグラム表示については図S7を参照）。寄生虫の形態の漫画は、データポイントがサンプリングされた細胞内位置 (細胞体または細胞頂点) を示します。右: 示された細胞内位置でサンプリングされた SPMT の平均量。サブボリュームの平均化は SPMT に焦点を当てていますが、大きなサブボリューム (200 nm エッジ) を抽出した後の EM マップでは IMC および APR コンポーネントが確認できます。これは、一貫した SPMT-IMC の距離と向きの結果です。平均的な体積を下回る漫画は、各場所のペリクル構造のモデルです。 IMCはトーラス形のスポロゾイトAPRの周りを包み込むため、単一の頂端dIMCを測定することができなかったことに注意してください（頂端φIMC角度は図S6bに示されています）。生殖母細胞パネル (c) は、平均ではなく個々の SPMT の断面を示し、それらの一貫性のない配向とプロトフィラメントの数の違いを示しています。 *生殖母細胞の向きの割り当ての詳細と仮定については、補足資料を参照してください。 d フォーム間の dIMC を比較するヴァイオリンプロット。幅はデータ量に応じてスケーリングされます。

共通のリンカーがあらゆる形態の SPMT を IMC に繋いでいるという仮説と、蚊の形態の SPMT には優先的な放射方向の配向がある (図 2e、3b、S6b、c、S7) という知識をもとに、我々は調べ始めました。リンカー結合部位用。明らかに非対称な構造的特徴であるため、明確な候補は縫い目でした。継ぎ目、微小管の中心、および IMC 表面上の最も近い点の間の角度 φIMC を測定しました (継ぎ目の向きの詳細については補足情報を参照)。

考えられるすべての SPMT の平均 φIMC を分析すると、蚊段階の SPMT だけが設定された半径方向極性を持っていることが明らかになりました。驚くべきことに、継ぎ目はIMCから離れた方向を向いており、代わりにプロトフィラメント8がそれに向かって配向されている(図6a、b、S6、S7)。蚊の形態とは対照的に、配偶子細胞ではφIMCのクラスター化は観察されず、この生活環の形態ではリンカータンパク質が特定の結合位置を持たないことが示唆されました（図6c）。

これらの結果は、すべての SPMT 上でリンカーの普遍的な結合部位を見つけたわけではありませんが、ILH が IMC に対する放射方向の設定に関与していることを示唆しました。私たちは、可能性のある手がかりを求めて、蚊の段階の SPMT EM 密度マップを検査しました。低い輪郭レベルでも、SPMT と IMC の間に結合密度はなく、リンカータンパク質が柔軟であるか、低い占有率で存在することを示しています。それにもかかわらず、プロトフィラメント10、11、12の間の未知のタンパク質密度による放射状に非対称な装飾の証拠がいくつかあり、追加の密度がプロトフィラメント11と12から放射状に外側に広がりました（図S8）。これらの密度が SPMT-IMC リンカーの一部に対応する場合、観察されたプロトフィラメント 8 の IMC 方向を向いた放射状配向を確立するには、追加の SPMT-IMC 接続 (おそらくプロトフィラメント 6 または 7) が必要になる可能性があります。したがって、リンカーの正確な詳細はまだ解明されていないが、我々は、蚊の形態の微小管における非対称修飾と放射極性（おそらくILH依存性である）の証拠を提示する。

熱帯熱マラリア原虫は複雑な生活環を進化させ、人間の宿主や媒介蚊の体内で複数の異なる組織を移動します。新しい環境ニッチごとに、寄生虫は極端な形態変化を起こします。寄生虫がそれぞれのニッチに特化した新しい形状に変形するにつれて、その微小管は分解され、その後、珍しいMTOCによって調整された複数のユニークで目的に適した構造に再組み立てされます（図7）。オーキンテの頂端は最も精巧であり、チューブリンベースの円錐体を含んでいますが、生殖母細胞は、APR の欠如と微小管構造の多様な集団により、他の形態の中で際立っています (図 5、7)。

a 分析された 4 つの Plasmodium 型の漫画表現。 b 4 つの形式の主なアーキテクチャの違いをまとめた表。実線の輪郭は相関関係があると思われる特性を示しています。頂端極性リングの存在は SPMT 極性を設定し、ILH は IMC に対する継ぎ目の方向の設定に直接関係しています。

生殖母細胞は、13 ～ 18 本のプロトフィラメントをもつ一重項や巨大な二重項、三重項、四重項など、広範囲かつ多様な微小管構造を持っています。このような大きな構造的多様性はこれまでのところ前例がなく、根底にあるメカニズムと生理学的役割について疑問が生じています。私たちの現在の理解によれば、プロトフィラメントの数は厳密に制御されていますが、生殖母細胞ではどうやらそうではありません。微小管は、生理的濃度よりもかなり高い濃度であっても、インビトロで自己集合する傾向があります。この自発的な自己組織化により、プロトフィラメント数が広範囲に分布した微小管集団が形成されます (ウシ脳チューブリンの場合は 9 ～ 16)1,16。しかし、生殖母細胞における巨大な非標準的SPMTの重合は、細胞質内で自発的に起こるのではなく、成長中のIMCプレートの表面に限定されるため、核形成のない自己集合が原因である可能性は低い。さらに、細胞質微小管集団のグループが時折観察され、おそらく直径に従ってクラスター化されており（図S5e）、これは制御レベルが利用可能であることを示唆しています。

プロトフィラメントの数の増加は、翻訳後修飾の変化、または新規の MAP またはチューブリンアイソフォームの発現が原因である可能性があります。マラリア原虫属 1 つの β-チューブリンアイソフォームと 2 つの α-チューブリンアイソフォームを発現します。 α1- チューブリンと α2- チューブリンは約 95% の配列同一性を示しますが、重要な領域にいくつかのアミノ酸置換があります。例えば、α2-チューブリンは、そのC末端（多くの場合、翻訳後修飾の標的）で3つのアミノ酸を欠損しており、配列内の最も保存されていない領域は、プロトフィラメント内相互作用を媒介する可能性があるループに対応します。これらの小さな変化は最終的に微小管格子の変化をもたらし、B 細管の形成を促進し、ダブレットやトリプレットにつながる可能性があります 36。さらに、ヒトにおけるチューブリンアイソフォームに関する以前の研究では、微小管内のアイソフォームの相対的な割合が微小管格子を調節できることが示されており 37 、観察されたプロトフィラメント数の範囲についての考えられる説明が提供されています。 α2-チューブリンはすべての生活環の形態で発現すると考えられますが、その相対的な発現は性的段階で最も高くなります 38,39。このアイソフォームは、無性期から精製された微小管には存在せず 40、無性型では必須ではなく 41、P. berghei スポロゾイトでは部分的にのみ α1-チューブリンを置き換えることができます 42。

熱帯熱マラリア原虫は、伸長した生殖母細胞を生成する唯一のマラリア原虫種であり 43、その SPMT はポリグルタミン酸化されていることが示されており、これがその安定性に役割を果たしている可能性があります 28,44。成熟した配偶子細胞は変形性を低下させ 45 、これが骨髄の隔離部位からの配偶子細胞の早期放出を阻害する役割を果たし、したがって脾臓のクリアランスを回避します 46。生殖母細胞は、すべての微小管が組み立てられるステージ IV で最も硬くなります。しかし、SPMT の大部分が分解されるステージ V ではセルは再び変形可能になり、セルの剛性と SPMT との関連性が示唆されます。

私たちは、巨大な微小管が標準的な形態よりも大幅に硬い（曲がりにくい）と予想しています。 13 個のプロトフィラメントから 17 または 18 個のプロトフィラメントへの移行は、個々の微小管の剛性を大幅に増加させると予想されます。13 個から 15 個のプロトフィラメントへの変更は剛性の 35% の増加をもたらすと予測されています 47。この剛性の増加は、たとえば、15 プロトフィラメント微小管が機械伝達に関与している機械感覚細胞で証明されています。生殖母細胞の周囲の表面積は限られているため、IMC の内面に適合できる微小管の数は限られています。したがって、微小管の数を最大化し、より大きくより硬い微小管を組み立てることにより、熱帯熱マラリア原虫配偶子母細胞が拡張された硬い形態に成長し、成熟するまでヒト宿主内で邪魔されずに発育できる可能性がある。

一方、2 つの蚊の形態は、13 本のプロトフィラメントで作られ、特徴的に ILH で強化された独自の SPMT を持っています。私たちの観察は、微小管細胞骨格で ILH を利用する生物のリストの増加に貢献しており、現在、そのリストにはアピコンプレクサの SPMT 14,27 や一部の哺乳類の繊毛と鞭毛 25,26 が含まれています。我々の観察によると、TrxL1 および SPM1 様タンパク質からなる ILH はアピコンプレックス全体で保存されているようですが、それは一部の生活環形式でのみ保存されているようです。公開されたデータにおける TrxL1 発現プロファイルは我々の観察と一致しており、その転写はオーキネテおよびスポロゾイトで強く上方制御されており、血液段階では相対的な発現は非常にわずかです 38,48。 TrxL1-GFP および SPM1-GFP 株では、スポロゾイトで高レベルの発現が見られました (図 S2)。興味深いことに、哺乳類には、肺の繊毛と精子鞭毛に局在する TrxL1 のホモログ (チオレドキシン様 Txl-249) と、軸糸にある SPM1 のホモログ (軸索微小管の安定化剤 SAXO250) が存在しており、ILH が共通のものである可能性があることが示唆されています。真核生物の特徴。

ILH は、微小管プラス端での代謝回転を制限し、縦方向 (SPM1 経由) と横方向 (TrxL1) の両方で SPMT を強化すると仮説が立てられています 25,26。 T. gondii の SPM1 ヌル変異体は適応度が低下していました 12。これは2番目の研究では見られませんでしたが、SPM1またはTrxL127が欠損している場合、微小管は化学的処理に対してより感受性がありました。 ILH は、繊毛、鞭毛末端、アピコンプレクサ滑走形態などの運動器構造で発生することが顕著です。したがって、ILH は柔軟性を犠牲にすることなく安定性を提供し、破損が発生した場合でも SPM1 が両端を保持し、SPMT の修復または自己修復を可能にすると仮定します。剛性のみが必要な場合、マラリア原虫の生殖母細胞は、多数のプロトフィラメント、ダブレット、トリプレットを備えた高密度の SPMT シートを進化させました。

細胞骨格要素としての SPMT の機能は、IMC への物理的な接続に依存しています。 SPMT と IMC の間の結合を研究したところ、ILH を含む SPMT の IMC に対する回転方向が設定されていることがわかりました。驚いたことに、縫い目は IMC の方向を向いていませんでした。これは、平らにした界面活性剤で可溶化した T. gondii14 の継ぎ目の配向に関する以前のデータと一致しており、これを明らかにしています 14 が、継ぎ目は外部結合 MAP がアクセスできる唯一の真に非対称な微小管の特徴であるため、依然として驚くべきことです。代わりに、ILH が回転方向を直接設定している可能性があります。 ILH を持たない生殖母細胞は、明らかにランダムな放射極性を持っています。これについての我々の証拠は、ダブレットφIMCの大きな分散であったが、これを超えて、非カノニカル微小管のスーパーツイストと、特定のプロトフィラメントを優先するリンカーとを調和させることも困難である（異なるプロトフィラメントが微小管としてIMCに向けられるため）ツイスト）。我々は、メロゾイトの13プロトフィラメントSPMTのラジアル極性も、ILHのような非対称の特徴がないと考えられるため、ランダムであると提案します。

ILH が SPMT を方向付ける方法については、2 つのメカニズムが考えられます。 ILHコンポーネントと外部MAPの間の直接接触、またはSPMTを楕円形の断面に強制することによって（図S1）、そこでは一貫性のないプロトフィラメント間の角度が結合部位として認識される可能性があります。プロトフィラメント11と12、およびプロトフィラメント9から12の間の尾根から発せられる弱い密度を観察しました（図S8）。これらの密度は、キネシンやダブルコルチンなどの既知の MAP とは一致しませんが、C1 対称 EM 密度マップの解像度は決定的になるほど高くありません。それらがIMC上の最も近い点を向いていないことを考慮すると、それらが推定上のSPMT-IMCリンカーに対応するかどうかは明らかではない。 SPMT の非対称回転配向の進化を理解するための枠組みは、SPMT が古代の鞭毛に由来するという最近提案された仮説である可能性があります 51,52。 SPMTを含むILHの配向は、膜に対する軸索のA細管の配向とほぼ一致しています。この半径方向の極性が方向性滑空の調整にとって重要であるかどうかは、テストする必要があります。

マラリア原虫の形態間の微小管構造の違いは明らかな疑問を投げかけます。これらのさまざまな微小管はどのように核形成されるのでしょうか? ILH を有する SPMT は SPM127 によって核形成される可能性があることが示唆されています。次に、TrxL1 は、そのオリゴマー状態の曲率を通じてプロトフィラメント数を 13 に設定できます。これは単独ではもっともらしく思えますが、新しいデータに照らしてみるとそうではありません。それは、ILHを欠く生殖母細胞やメロゾイト13プロトフィラメントSPMTの巨大な微小管がどのようにして核形成されるのかを説明していない。さらに、TrxL1に結合したプロトフィラメントの曲率は、標準的な13プロトフィラメント微小管の曲率から逸脱しており（図S1）、プロトフィラメント13と1の間のILHにはギャップがあり、ここに追加のプロトフィラメントが挿入される可能性があります。 SPMTマイナス末端はすべての形態から観察されたすべての微小管でキャップされていなかったため、γTuRCは核形成メカニズムである可能性は低いです（図S4）。 γTuRC キャップが分解された可能性はありますが (たとえば、γ-チューブリンはシゾントで発現します 53)、マラリア原虫微小管の安定性を考慮すると、これは驚くべきことです。配偶母細胞における巨大微小管核形成の性質を推測することは困難です。一方では、13から18のプロトフィラメント数を可能にするSPMTのγTuRC非依存性核形成について推測することができます。しかし他方では、紡錘体微小管上にγTuRC様構造が存在するにもかかわらず、均一な微小管を生成できないのではないかと考えられます。人口。最近のデータは、配偶子細胞の少なくとも初期の SPMT は、核膜に位置する中心小体プラークで核形成されることを示唆しています 44。このモデルを使用して、異なる直径の微小管と観察された SPMT のランダムな極性をどのように実現できるかについては、まだ調査する必要があります。これらのデータを総合すると、新しい SPMT 核形成メカニズムと、それに伴う抗マラリア薬の潜在的な標的が示唆される可能性があります。

この研究では、熱帯熱マラリア原虫の生活環全体にわたる微小管構造の変態を明らかにします。最も高いレベルでは、驚くべき構造的多様性により、少数のモデル生物への過度の依存から生じる標準的な微小管についての先入観を再評価する必要があります。ここで提示される in situ データの高解像度と最適な構造保存は、生物の細胞骨格の全体像を得るために、他のより還元主義的な方法からの発見を統合するためのフレームワークを提供します。現在利用可能なこれらの技術を使用して、より多くの細胞タイプが研究されるにつれて、真核生物の微小管構造とそのニッチ機能の真の多様性は、現在予想されているよりも大きくなるだろうと我々は期待しています。

熱帯熱マラリア原虫の血液型は、ヒト赤血球 (O + または B + 、Universitätsklinikum Eppendorf、Hamburg、Germany) で、5% ヘマトクリット、1% O2、5% CO2、および 94% N2、37 °C の RPMI で培養されました。 0.5％Albumax II54を含む完全培地。

60% 予熱した Percoll55 を使用してシゾントを収集し、予熱した RPMI で 1 回洗浄し、予熱した RPMI 中の 5% 非感染赤血球に再懸濁し、寄生虫が退出して再侵入するまで 3 時間培養しました。未破壊のシゾントを 5% ソルビトールで溶解しました。残りの文化には、3 時間の同時性ウィンドウを持つ若いリングが含まれていました。

内因的に GFP タグ付き GAPM2 (複数の膜幅を持つグリデオソーム関連タンパク質 256,57) を発現する緊密に同期した 3D7 シゾントを、60% Percoll 55 を使用して 10 ～ 20 mL の培養物 (5 ～ 10% 寄生虫血症) から単離し、前洗浄液で 2 回洗浄しました。 RPMI を加温し、1 μM の PKG 阻害剤化合物 2 (英国フランシスクリック研究所の Mike Blackman 博士提供) 58,59 で処理し、6 時間インキュベートしました。セグメント化されたシゾントを一度洗浄し、アルブマックスまたはフェノールレッドを含まず、ただし寄生胞性液胞を破裂させるが赤血球膜の破裂を防ぐために 1 μM E64 (Sigma) を添加して、予熱した RPMI に再懸濁しました。これは、SEM で非常に後期段階のシゾントを特定するのに役立ちました。細胞は保温され、1 時間以内にガラス化されました。

生殖母細胞段階は、縫合糸内膜複合体タンパク質 PF3D7_1345600 (プラスミド 57) の GFP タグ付きバージョンを過剰発現する、前述 60 の 3D7 誘導性生殖母細胞生産株 (iGP) を使用して、性的関与因子 GDV1 (生殖母細胞発生 1) を標的とした過剰発現によって生成しました。 GDV1-GFP-DD の発現は、2 ～ 3% のリングを含む寄生虫培養物に 2 または 4 µM Shield-1 を添加することによって達成されました。シールド-1 は再侵入までさらに 48 時間維持されました。サンプルを 10% 寄生虫血症に調整し、10% ヒト血清 (血液型 AB+) を補充した RPMI で 10 日間培養して、生殖母細胞を成熟させました。非コミット無性形態を枯渇させるために、生殖母細胞を 50 mM N-アセチル-d-グルコサミン (GlcNac) で少なくとも 4 日間処理しました。培地は、37 °C の加熱プレート上で少なくとも 1 日に 1 回交換されました。生殖母細胞のステージ II、III、IV、および V を、60% 予熱した Percoll を使用して 20 mL 培養物から生殖母細胞の成熟中のさまざまな時点で単離しました。単離した生殖母細胞を2回洗浄し、アルブマックス、血清、フェノールレッドを含まない予め温めたRPMIに再懸濁し、凍結直前まで保温(15分〜45分)した。

csp プロモーターの制御下、ゲノム組み込み、選択マーカーなし 61 の熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト (株: NF54-ΔPf47-5'csp-GFP-Luc: GFP ルシフェラーゼ融合タンパク質を発現) は、TropIQ (ナイメーヘン、オランダ) で調製されました。生後 2 日目の雌のハマダラカ属ステフェンシ蚊に生殖母細胞を与えました。蚊の感染は、感染後 7 日目に中腸の解剖によって確認されました。感染後 7 日目に、スポロゾイトの生産を促進するために、感染した蚊に非感染性の血液ミールを追加で与えました。感染から 2 週間後、唾液腺解剖を使用してスポロゾイトが単離され、室温でハンブルクに輸送されました。

オーキネテスは、構成的に RFP を発現する P. berghei ANKA 系統である P. berghei 系統 PbRFP を使用して作製されました。 2匹の雌のスイスマウスに200μlのフェニルヒドラジン(PBS中6mg/ml)を腹腔内注射して、網状赤血球増加症を刺激した。 2日後、マウスを20*106個のiRBC PbRFPで腹腔内に感染させた。感染後 3 日目にマウスから採血し、500 μl の血液を 10 ml オキネート培地 (20% (v/v) FCS、50 μg/ml ヒポキサンチン、および 100 μM キサンツレン酸を添加した RPMI、pH 7.8 ～ 8.0 に調整) に移しました。 19℃で。２２時間の培養後、オーキネート培養物を５ｍｌの５５％ニコデンツ／ＰＢＳで下に置き、ブレーキをかけずに２１０×ｇで２５分間遠心分離した。精製されたオーキネットを含む中間相を収集し、PBSで洗浄し、EMのために直ちにプランジ凍結した。

細胞は、プランジフリーザーの隣にある 37 °C のヒートブロックで保温されました。濃縮された寄生虫 3 μl を、湿度制御された施設内で新しくプラズマ洗浄した UltrAufoil R1.2/1.3 300 メッシュ EM グリッド (Quantifoil) に適用しました。過剰な液体を手動でバックブロットし、手動プランジャーを使用してグリッドをエタン/プロパンのリザーバーに突っ込みました。グリッドはイメージングまで液体窒素下で保管されました。

グリッドを FIB 調製用に修正されたオートグリッドにクリップし 62、Aquilos またはアップグレードされた Aquilos2 クライオ FIB/SEM デュアルビーム顕微鏡 (Thermofisher Scientific) にロードしました。概要タイルセットは、プラチナの薄層でスパッタコーティングされる前に、MAPS ソフトウェア (Thermofisher Scientific) を使用して記録されました。電子ビームとイオンビームの一致点がステージの傾斜によって各点で決定される前に、ラメラの調製に適した寄生虫のあるサイトが特定されました。ミリングの前に、GIS (ガス注入システム) を使用して有機金属プラチナ層がグリッド上に堆積されました。ラメラは、電流を段階的に減少させながら、300 nm 未満になるまで手動でミリングされました。薄いセルのラメラの長さを長くするために、ミリングは可能な限り低い角度で実行されました。最後に、すべてのラメラの研磨は、セッションの終了時にできるだけ早く、ただしラメラ表面への水の堆積による氷の汚染を制限するために常に 1.5 時間以内に行われました。サンプルを取り出す前に、グリッドはプラチナの最終薄層でスパッタリングコーティングされました。グリッドは、TEM でイメージングする前に液体窒素中で最大 2 週間保管されました。

FIB で加工したグリッドを 90°回転させ、K2 または K3 直接電子検出器と (バイオ) 量子エネルギーフィルター (Gatan) を備えた Titan Krios 顕微鏡 (Thermofisher) に装填しました。断層撮影データは、エネルギー選択スリットを 20 eV に設定した SerialEM63 で収集されました。データセットは、3°傾斜増分で±65°傾斜範囲で用量対称収集スキームを使用して収集されました。すべてのデータセットについて、5 ～ 10 のフレームが収集され、SerialEM を使用してオンザフライで位置合わせされ、総フルエンスは 120e-/Å2 未満に維持されました。３～８μｍのアンダーフォーカスの焦点ずれを使用して、傾斜シリーズを記録した。

SerialEM ではフレームがオンザフライで調整されました。 CTF 推定、位相反転、および線量重み付けは IMOD64 で実行されました。チルトシリーズは、パッチトラッキングを使用するか、基準マーカーとしてラメラ表面上のナノ粒子（おそらく金またはプラチナ）を使用することによって、IMOD で位置合わせされました。断層像は 4 回ビニングされ、IMOD または Bsoft65 を使用してフィルタリングされました。

SVA は、徐々に低いビニングで断層像を使用して PEET66 で実行されました。 SVA の初期 3D 座標 (モデル点または粒子座標) は、TEMPy67 に基づくスクリプトと Python ライブラリ Numpy、Scipy、および Matplotlib68、69、70 を使用して、IMOD で手動でトレースされた微小管中心間を補間することによって生成されました。点のペア間のベクトルを使用して、粒子の初期 Y 軸方向 (微小管擬似対称軸) を設定しました。各微小管は個別に処理され、初期配向でそれぞれの粒子を平均することによって生成された固有の基準（生の平均）に合わせて調整されました（図 S9）。その極性とプロトフィラメントの数を決定するために、Y 軸の周りの初期回転 (ここでは φ 回転と呼ばれます) がランダム化されました (図 S9、ステップ 2)。次いで、同じ数のプロトフィラメントを有する同じ形状からの粒子を組み合わせて、さらなる処理を行った。 SVAの進行は、各粒子の位置と配向が一対のマーカーで表されるUCSFキメラのピンモデルを検査することによって監視されました（図2e）。これにより、線形ジオメトリから外れ値を特定して削除することが可能になりました。粒子が他の粒子と重なり合っている場合、相互相関係数が低い場合、または初期位置から離れすぎている場合、粒子は除去されました。 SPMT マップは、Bsoft65 を使用して任意の B 因子を使用して鮮明化されました。

相対極性を決定したら、結合に必要なステップは、個々の微小管間の相対的な φ 回転 (対称軸の周りの回転) を見つけることです。これは、個々の粒子を共通の基準に合わせることによって行うことができますが、信号対雑音比が低いため、多数のエラーが発生します。我々は、Zabeo ら 25 の方法に類似した方法を開発しました。この方法では、微小管の平均体積を並べて微小管の相対的な φ 回転を求めることができます (図 S9 ステップ 4)。次に、これらの φ 回転がそれぞれの粒子に適用され、共通の基準に合わせられます。続いて、ボリュームをビニングして 4 回および 2 回 SVA を実行しました。スポロゾイトデータのみがビン化されていないボリュームと位置合わせされました。最後のステップは、傾きのセット全体で再構成されたボリュームを、±24° の間の傾きで再構成されたボリュームで置き換えることでした。制限された傾斜範囲では回転検索は実行されませんでした。得られた C1 EM マップは、微小管の回転方向の分布が不均一であるため、擬似対称軸の周りで異方性がありました。これに対処するために、粒子は方向によってクラスに分類され、最も豊富なクラスで相互相関係数が最も低い粒子が削除されました。これにより、スポロゾイトデータセットでは粒子の数が 24028 から 13263 に、オーキナイトデータセットでは 8377 から 1851 に減少しました。

25 枚の断層像からの約 200 個の微小管が、ランダムな初期 φ 回転で個別に処理されました。次に、データをプロトフィラメント番号によって手動で分類し、同じ極性になるように回転し、4 回および 2 回ビン化されたボリュームと位置合わせしました。らせんパラメータは、チューブリンサブユニットが分解されず公開されているパラメータを使用した 13 および 15 プロトフィラメントクラスを除き、クラス平均を使用して直接測定されました (表 S2)71。螺旋対称性が適用され、続いて SVA アライメントが適用されました。

SPMT ダブレットは、オーキネートおよびスポロゾイトのデータと同様の方法で処理され、平均体積を使用して相対的な φ 回転が決定されました。 A 尿細管と B 尿細管のプロトフィラメント数が異なる SPMT を組み合わせて、アンサンブル平均体積を求めました。

粒子は 2 つの半分 (偶数番号と奇数番号の粒子) に分割されました。最大 ±2 nm のランダムな座標オフセットと最大 ±3° のランダムな角度オフセットが各粒子に追加され、結果として得られたパラメータを使用して、各半分のデータセットの生の平均が再生成されました。次に、データセット全体と同じ手順に従って、2 回ビニングされたボリュームとその後ビニングが解除されたボリュームを使用して、2 つの半分の位置合わせを独立して実行しました。フーリエシェル相関は Bsoft を使用して測定されました。

EM マップと原子モデルは、UCSF (カリフォルニア大学サンフランシスコ校) Chimera72 または UCSF ChimeraX73 を使用して視覚化されました。計算セクションは IMOD で生成されました。

ClustalOmega74、75 を使用して TrxL1 タンパク質配列を整列させ、JalView を視覚化に使用しました 76。色はClustalXのカラーリングに基づいています。

セグメンテーションは、IMOD で描画ツールを使用して手動で実行され、続いて線形補間が行われました。結果として得られたモデルは、セグメント化されたボリュームを抽出するために使用されました。 SPMT、オーキネットコノイド、およびスポロゾイト APR をバックプロットしました。SVA によって決定された座標を使用して、平均体積を 3D 体積に配置しました。 SPMT および APR 粒子は、視覚化のために位置合わせエラーを滑らかにするためにスプラインフィットされました。セグメント化およびバックプロットされたボリュームは、UCSF ChimeraX73 を使用して視覚化されました。

断層像は、Bsoft を使用してバンドパスフィルター処理されました。フィルタリングされた断層像のセグメント化は、TomoSegMemTV を使用したテンソル投票アルゴリズムによって誘導されました 77,78。パラメータはデータセットごとにそれぞれ最適化されました。 IMC セグメンテーションを含むクラスターは、視覚分析によって手動で抽出されました。次に、クラスターは 3D 点群に変換され、Open3D ライブラリを使用してさらに処理されました78。統計的外れ値分析を使用して、セグメンテーションから過剰なノイズを除去しました。その後、DBSCAN アルゴリズムを使用して個々の膜セクションを分離し、その後の距離測定のために IMC の外側を手動で選択しました。角度 φIMC は、各 SPMT 粒子の 2 つのベクトル間で測定されました。SPMT 粒子の X 軸のベクトルと、粒子中心から最も近いセグメント化された IMC 座標までのベクトル (SPMT 粒子と交差する IMC 法線ベクトルとほぼ同等)。セグメント化された膜パッチの外側の粒子は除外されました。個々の微小管からの測定値は、プロットと統計分析のために中央値に換算されました。

自動セグメンテーションには透明な膜密度が必要であるため、分析に利用できる微小管の数が大幅に減少しました。したがって、メロゾイトの SPMT、生殖母細胞のダブレット、およびオーキンテのマイナス末端の希少性により、少数の断層像が IMOD で手動でセグメント化されました。

最初に、T. gondii SPMT モデル (PDB 7MIZ) が、Chimera72 の剛体として熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト SPMT EM マップにフィッティングされ、次にそのフィッティングが ChimeraX73 で視覚化されました。結果として得られた適合は、TgTrxL2 (マラリア原虫では発現されないが、トキソプラズマ ILH の一部である) がマップの外側にあり、残りのタンパク質鎖がマップの内側にあることで明確でした。熱帯熱マラリア原虫マップと熱帯熱マラリア原虫マップ間の楕円率の違いにより、プロトフィラメントと TrxL1/SPM1 ハーフアークは別個のユニットとしてフィッティングされました。 PfTrxL1 の構造予測 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q8I2W0)79 は、ChimeraX の matchmaker80 を使用して TgTrxL1 (PDB 7MIZ) と位置合わせされました。

プロトフィラメント間の角度は、隣接するプロトフィラメントの同じ残基対の Cα 原子間の角度を測定することによって決定されました。約 200 回の測定値の中央値が使用されました。

内因性タグ付けは、基本的に以前に記載されているように、単一クロスオーバー統合を使用して実行されました81。 SPM1 と TrxL1 はどちらも遺伝子全体の長さが 1 キロベース未満であるため、オープンリーディングフレーム全体が PbANKA 野生型ゲノム DNA から増幅されました。得られた DNA フラグメントを、EcoRI および BamHI 制限部位を使用して pL18 ベクター 82 にクローン化しました。リバースプライマーは、リンカーとして使用される 6 つのアラニンをコード化しました。 pL18 ベクターには、ピリメタミンという薬剤を使用したポジティブ選択用の hDHFR 遺伝子が組み込まれています。トランスフェクションの前に、SwaI (SPM1) と BsmI (TrxL1) をそれぞれ使用してベクターを直線化し、その後エタノール沈殿させました。 DNA フラグメントの生成に使用されるすべてのオリゴヌクレオチドと、PCR の遺伝子型決定に使用されるオリゴヌクレオチドを表 1 に示します。

線状化した pL18-SPM1-GFP/pL18-TrxL1-GFP ベクターをそれぞれ、標準プロトコルを使用して未修飾 P. berghei ANKA 株にトランスフェクトしました 83。トランスフェクションの１日後に、マウスの飲料水を介してピリメタミン（０．０７ｍｇ／ｍｌ）を経口投与することによって、所望のＤＮＡ構築物を組み込んだ寄生虫を選択した。マウスが 1 ～ 3% の感染赤血球を示したら、麻酔をかけたマウスから心臓穿刺によって血液を採取しました (100 mg/kg ケタミンおよび 3 mg/kg キシラジン、Sigma-Aldrich)。寄生虫株の永久保存のために、200 μl の凍結溶液 (Alsever 溶液中の 10% グリセロール、Sigma-Aldrich) と混合した 100 μl の全血のアリコートを液体窒素中で保存しました。

正しい組み込みを検証するために、ゲノム DNA を全血から単離し、遺伝子型別 PCR によって正しい構築物の組み込みをテストしました。このために、まず赤血球を、0.03%サポニンを含む1.5mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で溶解した。遠心分離と 2 回の洗浄ステップの後、メーカーのプロトコールに従って Blood and Tissue キット (Qiagen Ltd) を使用してゲノム DNA を単離しました。これらのトランスフェクションによる寄生虫の混合（親）集団が蚊の感染に使用されました。

プラスミドおよびオリゴヌクレオチドは、SnapGene ソフトウェアバージョン 3.2.1 (Insightful Science、snapgene.com で入手可能) を使用して設計されました。画像は Fiji (バージョン: 2.0.0 rc 64/1.51 s) で分析されました84。

凍結（非クローン）原虫ストックを解凍し、1 匹のマウス（6 ～ 8 週齢のメスのスイスマウス）に腹腔内（100 ～ 150 μl）を直接注射し、血液塗抹標本によって感染をモニタリングしました。感染マウスの感染赤血球数が 2 ～ 3% に達したら、マウスを麻酔し (100 mg/kg ケタミンおよび 3 mg/kg キシラジン、Sigma-Aldrich)、採血し、2,000 万個の寄生虫を 2 匹の未処理レシピエントマウスに腹腔内注射によって移入しました。新鮮な血液を移入してから 3 日後、マウスに麻酔をかけ（120 mg/kg ケタミンおよび 16 mg/ml キシラジン）、約 200 匹のメスのハマダラカ蚊が入ったケージに置き、砂糖と塩のパッドを除去して 3 ～ 5 時間飢餓状態にさせました。。蚊に 15 分から 30 分間マウスを食べさせました。感染後、蚊を 21 °C、湿度 70% に保ちました。

唾液腺スポロゾイトは、蚊の血液粉砕後 19 日目に単離されました。この目的を達成するために、唾液腺を氷上でRPMI中で解剖し、乳棒で粉砕した。続いて、チューブをＲＰＭＩで１ｍｌまで満たし、溶液の下に３ｍｌの１７％アキュデンツ（正確な化学および科学の協力）を慎重に加えた。室温、1600×gで20分間の遠心分離により、細胞破片からスポロゾイトを分離した。中間相を含むスポロゾイトを回収し（総量１．４ｍｌ）、スポロゾイトを１００×ｇで３分間遠心分離した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｉｏｆｕｇｅｐｒｉｍｏ）。ペレット化したスポロゾイトを 3% ウシ血清アルブミン (ROTH) を含む RPMI に再懸濁すると、活性化されたスポロゾイトが得られました。得られた混合物を光学底９６ウェルプレート（Thermo Fisher Scientific）のウェルに移し、プレートを２００×ｇで３分間遠心分離した（Multifuge S1-R、Heraeus）。スポロゾイトは、落射蛍光顕微鏡 (CellObserver、Zeiss) および 25 倍 (NA 0.8、水) 対物レンズを使用し、80 ミリ秒の露光で画像化されました。スポロゾイト活性化後 1 時間まで画像を撮影しました。

生きている寄生虫の蛍光画像は、Leica DFC9000 GT カメラと Leica Plan Apochromat 60x または 100x / 1.4 油対物レンズを備えた Leica D6B 蛍光顕微鏡で撮影されました。 Fiji を使用して明確な寄生虫の形状を示すようにコントラストと強度を線形調整し、Adobe Illustrator CC 2021 を使用してトリミングされた画像を図 1 のセルの構成に組み立てました。

熱帯熱マラリア原虫生殖母細胞の 5 つの調製物が生成され、そのうち 6 つのグリッドが画像化されました。熱帯熱マラリア原虫シゾントの 5 つの調製物が生成され、そのうち 6 つのグリッドが画像化されました。の P. berghei オキネテスが生成され、3 つのグリッドが画像化されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成されたサブボリューム平均は、アクセッションコードスポロゾイト MT (EMD-15532)、生殖母細胞 MT: 13pf (EMD-15534)、14pf (EMD-15535)、15pf (EMD-15536)、16pf ( EMD-15537)、17pf (EMD-15538)、18pf (EMD-15539)。この調査で生成された距離測定データは、ソースデータファイルで提供されます。リクエストに応じて、すべての菌株とプラスミドを入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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リファレンスをダウンロードする

CSSB Cryo-EM および ALFM 施設のご支援に感謝いたします。 3D7-iGP 寄生虫については Till Voss、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトの提供については TropIQ、PbRFP ラインの共有については Andrew Waters と Katie Hughes に感謝します。結果について批判的なフィードバックをくれた Lindsay Baker と、有益な議論とアドバイスをくれた John Heumann と Carolyn Moores に感謝します。 Stackoverflow コミュニティが、一見底なしの正気を回復する知識のリポジトリであることに感謝します。この研究は、HFSP 長期ポスドクフェローシップ LT000024/2020-L (JLF)、EU の Horizon 2020 プログラム (助成契約 No 731060) (JLF) によって資金提供されたベクター媒介疾患制御のためのインフラストラクチャー (Infravec2)、 Marie Curie に基づく EMBL 学際的ポスドクプログラム COFUND アクション MSCA-COFUND-FP (助成契約番号: 847543) (MS)、ドイツ感染症研究センター、DZIF (FH)、DFG-FR 2140/10-1 (AMB)、DFG リサーチネットワーク SFB 1129、SPP 2332、補助金 FR 2140/10-1 (FF)、CSSB KIF-002 (TWG および KG)、DFG 研究ネットワーク SPP 2225 (TWG)、ウェルカムトラスト補助金 107806/Z/15/Z および 209250/ Z/17/ Z (KG)、BMBF 許可 05K18BHA (KG)、DFG INST 152/ 772-1、774-1、775-1、777-1 FUGG (CSSB クライオEM 施設)。

Projekt DEAL によって実現および組織されたオープンアクセスの資金調達。

ジョシー・L・フェレイラ

現在の住所: 構造分子生物学研究所、バークベック、ロンドン大学、ロンドン、英国

これらの著者も同様に貢献しました: Josie L. Ferreira、Vojtěch Pražák。

構造システム生物学センター、ハンブルク、ドイツ

ジョシー・L・フェレイラ、ヴォイテク・プラジャーク、デイヴン・ヴァシシュタン、マルク・シゲル、エマ・ピエチュ、ヤン・コシンスキー、ティム・W・ギルバーガー、ケイ・グリューネヴァルト

ライプニッツウイルス研究所 (LIV)、ハンブルク、ドイツ

ジョシー・L・フェレイラ、ヴォイテク・プラジャーク、デイヴン・ヴァシシュタン、ケイ・グリューネヴァルト

ベルンハルト・ノヒト熱帯医学研究所、ハンブルク、ドイツ

ジョシー・L・フェレイラ、エマ・ピエチュ、ティム・W・ギルバーガー

オックスフォード大学ウェルカム人類遺伝学センター、構造生物学部門、オックスフォード、英国

ヴォイテク・プラジャーク、デイヴン・ヴァシシュタン、ケイ・グリューネヴァルト

ヨーロッパ分子生物学研究所、ハンブルク、ドイツ

マルク・シゲル & ヤン・コシンスキー

統合寄生虫学、ハイデルベルク大学医学部感染症センター、ハイデルベルク、ドイツ

フランツィスカ・ヘンツシェル、アニカ・M・ビンダー、フリードリヒ・フリシュクネヒト

ドイツ感染研究センター、DZIF パートナーサイトハイデルベルク、ハイデルベルク、ドイツ

フランツィスカ・ヘンツシェル & フリードリヒ・フリシュクネヒト

ハンブルク大学、ハンブルク、ドイツ

エマ・ピッチ、ティム・W・ギルバーガー、ケイ・グリューネヴァルト

構造および計算生物学ユニット、EMBL、ハイデルベルク、ドイツ

ヤン・コシンスキー

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JLFおよびEPは血液期寄生虫を培養し、AMBおよびFHは蚊期寄生虫を調製した。 AMB はトランスジェニック P. berghei 株を生成し、蛍光局在実験を実施しました。 JLF は、蛍光顕微鏡検査、EM グリッドの準備、FIB ミリングおよび電子顕微鏡データ収集を実行しました。 JLF と VP は、断層撮影データ処理、サブボリューム平均化、および極性分析を実行しました。 VP と DV は、楕円率分析とフィッティングを含む断層撮影データの追加分析を実行しました。 VP と MS は、断層撮影データの距離と角度の分析を実施しました。 JLF、VP、MS は断層像セグメンテーションを実行しました。 JLF、VP、AMB、EP が用意した数値。 JK、FF、TWG、KGがプロジェクトを監修しました。 JLF と VP がオリジナルの原稿テキストを書き、JLF、VP、DV、MS、FH、EP、JK、FF、TWG、KG によってレビューおよび編集されました。

ケイ・グリューネヴァルトへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

寄生虫の繁殖や蚊の感染などの in vivo 実験には、ジャンヴィエ研究所から入手した生後 8 ～ 10 週齢の雌のスイスマウスを使用しました。すべての動物実験は、FELASA カテゴリ B および GVSOLAS 標準ガイドラインに関する欧州規制に従って実施されました。動物実験はドイツ当局 (Regierungspraesidium Karlsruhe、ドイツ)、§ 8 Abs によって承認されました。 1 Tierschutzgesetz (TierSchG) はライセンス G-111/20 に基づき、国内および欧州の規制に従って実施されました。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Andreas Hoenger、Leann Tilley、Li-Av Segev Zarko に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

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転載と許可

フェレイラ、JL、プラジャーク、V.、ヴァシシュタン、D. 他マラリア原虫の微小管構造の変化。 Common Nat 14、1216 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36627-5

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受信日: 2022 年 11 月 7 日

受理日: 2023 年 2 月 9 日

公開日: 2023 年 3 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36627-5

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